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20 maggio 2017

GIHTAD (2017) 10:4
Articolo originale

Genomica e proteomica: applicazioni cliniche e spunti di ricerca in Oncologia dei tumori solidi

Genomics and proteomics: clinical applications and research opportunities in solid tumor Oncology

Giovanni Guarrera1 • Stefano Pizzolitto2 • Giovanna De Maglio2 • Marco Piemonte3 • Giuseppe Aprile4 • Gianpiero Fasola4

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1 Area Sistemi di Governance Azienda Provinciale per i Servizi Sanitari della Provincia Autonoma di Trento, Trento – Italy
2 SOC Anatomia Patologica, Azienda Sanitaria Universitaria Integrata di Udine, Udine – Italy
3 SOC Otorinolaringoiatria, Azienda Sanitaria Universitaria Integrata di Udine, Udine – Italy
4 Dipartimento di Oncologia, Azienda Sanitaria Universitaria Integrata di Udine, Udine – Italy

Indirizzo per la corrispondenza:
SOC Anatomia Patologica,
Azienda Sanitaria Universitaria Integrata di Udine
Via Pozzuolo, 330
33100 Udine – Italy
e-mail: giovanna.demaglio@asuiud.sanita.fvg.it


Abstract

Personalized precision medicine in oncology has the goal of molecular characterization of tumors for those biomarkers that are recognized targets for specific drugs.

The National Institutes of Health defines genomics as the study of the entire genome of an organism. The main difference between genetics and genomics is that the first focuses on the functioning and composition of the single gene while the second addresses all genes and their relationships.

Proteomics is a large-scale study of the entire set of proteins produced or modified by an organism or a cellular system in terms of quantifications, modifications, structural and functional alterations and interactions between proteins of the same molecular network.

After the end of the Human Genome Project in 2001, genomics studies and molecular genetics applications spread in oncological clinical practice with several genetic tests developed for the investigation of germinal hereditary mutations and/or somatic acquired mutations. Also proteomics found a diffuse implementation with studies of gene expression profiling.

Translational research in the field of genomics and proteomics is increasing with the aim of finding clinical biomarkers relevant for the purposes of diagnosis, prognosis and prediction of treatment response.

Health Technology Assessment evaluations are essential in this field before the introduction into clinical practice not only of a new target drug, but also of screening tests aiming at target identification.


 

Definizioni e principi generali

La caratterizzazione delle alterazioni genetiche dei tumori rappresenta il fondamento su cui si basa la medicina personalizzata o medicina di precisione, che mira all’identificazione, in ciascuna patologia di ciascun paziente, di quei biomarcatori che rappresentano il bersaglio contro il quale sarà rivolto il farmaco targeted (a bersaglio). I biomarcatori sono degli indicatori biologici che devono poter essere identificati, misurati e valutati oggettivamente

Il NHI (National Institutes of Health) definisce la genomica come lo studio dell’intero genoma di un organismo, differenziandola dalla genetica, che riguarda lo studio di un particolare gene [1].

Con proteomica si definisce invece lo studio su larga scala dell’intero complesso proteico e delle sue alterazioni proteiche, prodotto da un organismo o da un sistema cellulare. Lo studio proteomico include informazioni quantitative sulla relativa abbondanza di una proteina, sulle sue variazioni e alterazioni strutturali, fino alla complessa interazione con le altre molecole facenti parte dello stesso network molecolare al fine di comprendere i processi cellulari nel loro insieme (Figura 1).

 

Figura_1

Fig. 1. I dati di “Omics” permettono di descrivere e interpretare meccanismi e interazioni a diversi livelli nella cellula. (Mod. da [2])

Dopo il completamento della mappatura del genoma umano nell’ambito dello Human Genome Project avvenuto nel 2001, la genomica e la genetica molecolare si sono sviluppate rapidamente sia per quanto riguarda i test genetici volti al rilevamento delle alterazioni germinali (informazioni genetiche ereditarie), sia per quelli che identificano le alterazioni somatiche (mutazioni acquisite, non ereditarie, per esempio quelle caratteristiche di un tumore).

Progressi si sono avuti similmente anche nello sviluppo di tecniche di proteomica con la possibilità di analizzare non soltanto l’espressione genica mediante tecniche ad alta processività di campioni, ma anche le vie di trasduzione del segnale che sottendono alla complessità dei processi cellulari. Lo sforzo della comunità scientifica è ora quello di trasferire le conoscenze genomiche e proteomiche nella pratica clinica per dare risposte clinicamente utili in tema di prevenzione, diagnosi, prognosi e predittività dei trattamenti, che siano sempre più accurate, rapide e personalizzate.

Le applicazioni cliniche della genomica e della proteomica possono infatti riguardare l’identificazione, a livello di DNA, RNA o proteine di:

a) marcatori e/o le loro modificazioni, peculiari di una patologia (biomarcatori diagnostici);

b) marcatori in forma normale o alterata correlati a una particolare prognosi della malattia (biomarcatori prognostici);

c) marcatori in grado di predire la risposta di una patologia a specifiche terapie (biomarcatori predittivi);

d) marcatori precoci di malattia e biomarcatori in grado di etichettare il rischio di sviluppare una data patologia (biomarcatori di rischio) (Tabella 1).

 

Tabella 1. Applicabilità di genomica, proteomica e metabolomica per la gestione del paziente. (Mod. da [3])

Paziente Genomica Proteomica Metabolomica
Suscettibilità Predisposizione ●●●
Fattori ambientali ●●● ●●●
Rischio ●● ●● ●●
Prevenzione ●●
Diagnosi Diagnosi precoce ●●● ●●●
Stratificazione differenziale ●● ●●● ●●●
Trattamento Scelta ●●● ●●●
Risposta ●●● ●●●
Alternativa ●● ●●
Post-trattamento Effetti collaterali ●● ●●
Monitoraggio ●●● ●●●
Prevenzione ●● ●●
● = poco appropriata, ● ● = appropriata, ● ● ● = molto appropriata

 

Se genomica e proteomica potenzialmente presentano molte opportunità per la cura dei pazienti, molteplici sono le sfide per un reale trasferimento delle conoscenze della ricerca di base alla pratica clinica – “from bench to bedside” – basti pensare alla necessità di sviluppare tecnologie e strumenti per raccogliere informazioni su varie classi di geni, proteine, dei loro ligandi, delle interazioni con altre molecole, delle interazioni fra pathway molecolari diversi e dei meccanismi regolatori dei vari processi biologici, che richiedono l’implementazione di sistemi informatici in grado di gestire ed elaborare una mole sempre maggiore di dati (Figura 2).

 

Figura_2

Fig. 2. Sfide e opportunità della medicina personalizzata. Lo schema mostra il cosiddetto ciclo dell’innovazione medica, dalla ricerca di base al trasferimento dei risultati nella sanità pubblica. (Mod. da [4]). HTA, Health Technology Assessment

 

Il trasferimento nella pratica dei progressi dalla genomica è limitato dal basso potere prognostico-predittivo della maggior parte dei marcatori identificati e della mancanza di infrastrutture in grado di raccogliere, valutare e diffondere le evidenze scientifiche, oltre che dalla non disponibilità di uno strumento condiviso per definire gli standard idonei a misurare l’utilità di questi test e l’attendibilità metodologica delle procedure analitiche [5]. La complessità e la trasversalità della genomica e della sua applicazione nella pratica clinica richiedono che, in questo processo di trasferimento, siano coinvolti diversi professionisti, diversi settori della ricerca e gruppi multidisciplinari di esperti.


 

Stabilire l’utilità clinica dei test genetici

Per garantire che le conoscenze genomiche siano integrate in modo appropriato, è necessario innanzitutto disporre di dati scientifici robusti, validati per la pratica clinica. Ciò vale a dire che questo processo sia basato su prove di efficacia evidence-based sia sul reale contributo diagnostico del test, sia sull’efficacia della tecnologia analitica. In secondo luogo è necessario che i professionisti coinvolti a vari livelli in questi programmi acquisiscano competenze ed expertise necessarie e aggiornate nel tempo.

L’identificazione e sviluppo di un potenziale biomarcatore, per esempio un marcatore predittivo di risposta a una determinata terapia oncologica, può idealmente essere riassunto, parallelamente a quello dello sviluppo e della introduzione di nuovi farmaci, in cinque fasi concettuali [6]. Queste comprendono studi esploratori preclinici, validazione clinica, studi retrospettivi, studi prospettici e trial clinici randomizzati riferibili allo sviluppo di un saggio per l’analisi di un biomarcatore, la valutazione della sua performance analitica, la sua validazione e introduzione nella pratica clinica, che portano poi all’approvazione, da parte degli enti regolatori, dei test come predittivi (Tabella 2).

 

Tabella 2. Fasi concettuali dell’identificazione e sviluppo di un nuovo biomarcatore. (Mod. da [6])

Fasi dello sviluppo di un nuovo farmaco
Preclinica Fase I Fase II Fase III Approvazione del farmacoTempo totale ≈ 90 mesi
(7,5 anni)
N=30 N=300 N=1600
≈ 18 mesi ≈ 18 mesi ≈ 18 mesi ≈ 36 mesi
Fasi di sviluppo di un nuovo saggio per biomarcatore associato ad un nuovo farmaco
Conferma del target Integrazione del biomarcatore Il biomarcatore è informativo? Validazione clinica Approvazione del metodo diagnostico associato
Sviluppo del saggio Effettuazione del saggio Validazione del saggio Endpoint co-primario

 

A oggi, la maggior parte dei biomarcatori utilizzati in medicina personalizzata sono biomarcatori di farmacogenomica.

Sebbene i candidati biomarcatori siano molteplici, il numero di quelli che raggiungono la validazione per l’applicazione nella pratica clinica rimane ancora relativamente limitato. Già il primo gap traslazionale dalla ricerca di base alla validazione preclinica prevede un elevato numero di potenziali biomarcatori identificati che non arrivano alla fase successiva della validazione. Un’ulteriore quota-parte di biomarcatori si perde nel secondo gap, non dimostrandosi applicabili nella pratica clinica. Solo i biomarcatori e i test di provata utilità clinica e costo-efficaci dovrebbero essere implementati nella pratica clinica e offerti nell’ambito del Servizio Sanitario Nazionale (SSN) secondo i principi di appropriatezza e sostenibilità (Figura 3) [5].

 

Figura_3

Fig. 3. Rappresentazione del fenomeno dell’innovation gap nella ricerca e sviluppo dei biomarcatori

 

Il processo finale di validazione di un biomarcatore in medicina predittiva include anche la validazione del metodo analitico per la sua analisi. L’applicabilità di un biomarcatore è infatti imprescindibile dallo sviluppo di un test analitico robusto e appropriato, quello che in medicina personalizzata viene definito il companion diagnostic test. Non sono ancora del tutto chiariti gli standard richiesti per un companion diagnostic test, ma alcune caratteristiche riconosciute come indispensabili sono: un’elevata validità analitica, sensibilità e specificità analitiche appropriate, validità e utilità cliniche comprovate, capacità di rispondere al quesito clinico sul trattamento, accettabilità etica e sociale [4].

In tema di medicina personalizzata le classiche valutazioni di Health Technology Assessment (HTA), siano esse rivolte al farmaco, al test diagnostico per l’analisi di un biomarcatore, alla valutazione di una tecnologia, sono complicate dalla rapidità e complessità delle sempre maggiori conoscenze dei processi biologici, dalla rapidità dell’innovazione tecnologica e delle molecole target identificate. L’analisi di costo-efficacia di un farmaco target non è più solo legata al farmaco in sé, ma anche all’analisi di costo-efficacia del test di screening per l’identificazione del target [7]. Il quesito posto da Ijzerman et al. è se le attuali evidenze scientifiche e modalità di raccolta delle stesse siano effettivamente calzanti per studi di Comparative Effectiveness Research (CER) [8]. Di conseguenza anche la valutazione della strumentazione e della tipologia di test diventa necessariamente una valutazione di percorso e non più di tecnologia o di test diagnostico in sé.

Inoltre vi sono nuovi approcci in HTA quali quelli di Constructive Technology Assessment (CTA), volti a focalizzare il disegno, lo sviluppo e l’implementazione di nuove tecnologie che si affiancano alla classica analisi di costo-efficacia. L’analisi CTA viene definita una “very early HTA”, ossia una prima fase del processo di technology assessment, che precede la valutazione della tecnologia prima che questa venga introdotta nella pratica clinica [9].


 

Tecnologie in genomica

La rivoluzione tecnologica nel campo della genomica inizia più di 30 anni fa con le prime tecnologie di sequenziamento del DNA con il metodo Sanger. Questa tecnologia ha lo svantaggio di avere una sensibilità che non consente la rilevazione di mutazioni con una frequenza allelica inferiore al 20%. Una più innovativa tecnologia di sequenziamento è il pyrosequencing, una tecnologia di sequenziamento per sintesi di corti frammenti di DNA che consente, oltre a una sensibilità analitica maggiore rispetto al metodo Sanger, anche una quantificazione delle mutazioni.

Per l’analisi di mutazioni puntiformi in specifiche regioni geniche target si sono diffuse tecniche di genotipizzazione a elevata sensibilità quali PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitative allele specifiche o tecnologie a maggiore high-throughput quali tecnologie con spettrometria di massa fino ad analisi con tecnologia di Digital PCR che consente di raggiungere sensibilità analitiche fino allo 0,01%.

Queste piattaforme sono diffusamente utilizzate per l’analisi di mutazioni o alterazioni geniche codificate, ma non sono idonee per la definizione di profili genomici completi per le cui applicazioni si sono più recentemente diffuse tecniche di next generation sequencing (NGS) o massive parallel sequencing (MPS). Queste hanno tre maggiori vantaggi rispetto alle tecniche convenzionali: abbassamento dei costi di sequenziamento, aumento della sensibilità analitica, possibilità di analizzare in tempi molto ridotti larghe sequenze geniche fino a interi esomi (Tabella 3) [10].

Applicazioni in ambito di ricerca hanno permesso il sequenziamento dell’intero genoma (Whole Genome Sequencing, WGS), sequenziamenti dell’intero esoma (Whole Exom Sequencing, WES) o di pannelli specifici (“targeted sequencing”) (Tabella 3).

 

Tabella 3. Tipologie di alterazioni genomiche e tecnologie di analisi. (Mod. da [10])

Alterazioni molecolari nel cancro Tecnologie esistenti Tecnologie emergenti
DNA da tessuto tumorale
Mutazione puntiforme (sostituzioni/Indels) Sequenziamento capillare di Sanger Targ-Seq/WESRNA-Seq
Pyrosequencing
Genotyping
Aggiunta o perdita di copy number FISH Targ-Seq/WESWGS
IHC
Array CGH
SNP array
Riarrangiamenti, fusioni geniche Cariotipo WGSRNA-Seq
FISH
Sequenze patogenetiche PCR WGSRNA-Seq
Array microbici
Modifiche epigenetiche Sequenziamento con bisolfito e PCR metil-specifica ChIP-Seq
RNA da tessuto tumorale
Livelli alterati dell’espressione dei trascritti RNA microarray RNA -Seq
Alterata espressione allele-specifica RNA microarray
Splicing alternativo differenziale RNA microarray
CGH, Genomic Comparative Hybridization; ChIP-Seq, Chromatin Immunoprecipitation followed by massive parallel sequencing; FISH, Fluorescence in Situ Hybridization; IHC, Immunohistochemistry; PCR, Polymerase Chain Reaction; RNAseq, RNA sequencing; SNP, Single Nucleotide Polymorphism; Targ-Seq, Targeted Sequencing; WES, Whole-Exome Sequencing; WGS, Whole Genome Sequencing.

 

Le potenzialità di queste tecnologie nella pratica clinica sono rivolte all’indagine della singola cellula o di un numero limitatissimo di cellule e all’analisi del DNA tumorale circolante nel sangue e nei fluidi biologici (biopsia liquida) [11]. Ciò consente un monitoraggio delle malattie nel tempo, anche per un’analisi dei meccanismi di resistenza acquisiti durante i trattamenti farmacologici (Tabella 4, Figura 4).

 

Tabella 4. Metodiche di genotipizzazione in ordine di sensibilità analitica. (Mod. da [11])

Tecnica Sensibilità Applicazione ottimale
Sequenziamento di Sanger > 10% Tessuto tumorale
Pyrosequencing 10% Tessuto tumorale
Sequencing di nuova generazione 2% Tessuto tumorale
PCR quantitativa 1% Tessuto tumorale
ARMS 0,10% Tessuto tumorale
BEAMing, PAP, Digital PCR, TAM-Seq 0,01% o inferiore ctDNA, rare varianti di tessuto tumorale
PCR, Polymerase Chain Reaction; ARMS, Amplification Refractory Mutation System; BEAMing, Beads Emulsion Amplification and Magnetics; TAM-seq, Tagged-Amplicon deep sequencing.

 

Fig_4

Fig. 4. Alterazioni genetiche rilevabili nel DNA libero circolante. Le cellule tumorali rilasciano in circolo piccoli frammenti di DNA mediante diversi meccanismi. Questo DNA tumorale libero circolante può essere analizzato per la ricerca delle alterazioni genetiche e molecolari. (Mod. da [11])

 


 

Tecnologie in proteomica

La spettrometria di massa è la tecnologia principale usata in proteomica e consente il rilevamento e la quantizzazione delle proteine in una matrice biologica complessa. È una tecnica molto precisa che consente la distinzione delle proteine che differiscono in composizione per un solo atomo di idrogeno. Vi sono anche tecniche di elettroforesi su gel e metodi cromatografici. La tecnica del microarray per le proteine permette la determinazione dei livelli relativi a un gran numero di proteine presenti in una cellula con elevata processività. Una vasta gamma di metodi bioinformatici di calcolo sono stati sviluppati per analizzare la struttura, la funzione e l’evoluzione delle proteine. A livello di analisi di biomarcatori anche validati nella pratica clinica, le tecniche più diffuse sono l’immunoistochimica eseguita su cellule e sezioni di tessuto, le tecniche ELISA e di immunoenzimatica (Figura 5).

 

Figura_5

Fig. 5. Tipico workflow per uno studio proteomico di profilo di espressione. (Mod. da [3])

 


 

Applicazioni cliniche in Oncologia dei tumori solidi

Applicazioni nel carcinoma polmonare

Il tumore polmonare è una delle principali cause di morte nel mondo occidentale, viene diagnosticato in fase avanzata in oltre la metà dei casi e fino a pochi anni fa è stato trattato con chemioterapia (doppietta a base di platino in prima linea e monoterapia con docetaxel o pemetrexed in seconda linea). L’identificazione delle mutazioni attivanti del gene EGFR nel 2004 ha aperto la strada alla prima applicazione della genomica in oncologia toracica, cambiando radicalmente le prospettive di trattamento per il tumore polmonare non a piccole cellule. L’adenocarcinoma polmonare in particolare può essere considerato oggi come un insieme di diversi sottotipi legati all’alterazione di un singolo oncogene [12]. Le mutazioni più frequenti riguardano il gene KRAS (presente nel 20-30% degli adenocarcinomi e in meno del 5% dei carcinomi squamosi), per le quali però, al momento, non sono stati identificati farmaci attivi sul bersaglio molecolare. Subito dopo, in ordine di frequenza, vi sono le mutazioni attivanti del gene che codifica per il recettore EGFR (che riguardano gli esoni 19, 21 e 18) con una prevalenza variabile dal 5-10% nella popolazione caucasica fino al 50-60% nelle donne di origine asiatica non fumatrici [13]. Per questo sottogruppo di carcinomi polmonari sono oggi disponibili inibitori della tirosina chinasi (tyrosine kinase inhibitor, TKI) di prima e seconda generazione (gefitinib, erlotinib e afatinib) che rappresentano attualmente i farmaci di scelta per la prima linea di trattamento e grazie ai quali la sopravvivenza mediana complessiva ha raggiunto e superato, per i pazienti EGFR-mutati, i 24 mesi [14]. Nonostante la maggior parte dei casi presenti una risposta iniziale alla terapia, quasi invariabilmente nei 12-18 mesi successivi si determina una progressione di malattia legata alla proliferazione di cloni cellulari che presentano mutazioni molecolari che conferiscono resistenza all’effetto dei farmaci di prima e seconda generazione. La più comune mutazione di resistenza riguarda il codone T790 dell’esone 20 di EGFR ed è rilevabile in circa il 50% dei casi, non solo su cellule e tessuti tumorali, ma anche su DNA circolante plasmatico. La recente approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) statunitense e dell’Agenzia Europea per i Medicinali (EMA) di una nuova molecola, un inibitore TKI di terza generazione, osimertinib, consente di superare la resistenza, rendendo la malattia nuovamente sensibile, e di espandere la sopravvivenza libera da progressione di quasi un anno. I farmaci inibitori di EGFR sono somministrati per os e presentano mediamente un buon profilo di tossicità, anche se alcuni effetti collaterali, in particolare un’interstiziopatia, richiedono cautela e possono pregiudicare la prosecuzione del trattamento.

Un’ulteriore alterazione genica passibile di trattamento a bersaglio molecolare è la traslocazione del gene ALK, presente in una piccola percentuale di pazienti con adenocarcinoma (circa il 4%), prevalente in soggetti più giovani che non sono mai stati fumatori. Ove presente questa traslocazione consente il trattamento con crizotinib, piccola molecola TKI che ha dimostrato di essere nettamente più efficace della chemioterapia, anche in questo caso con somministrazione orale e un buon profilo di tossicità [15]. In Italia al momento crizotinib è registrato solo in seconda linea, mentre negli Stati Uniti e in altri Paesi europei è utilizzato comunemente in prima linea. Lo stesso farmaco si è rivelato efficace in una più rara alterazione genetica, il riarrangiamento dell’oncogene ROS1, presente in circa l’1% dei casi, più comunemente in soggetti non fumatori. Il tasso di risposta in questi pazienti è superiore al 70% con una sopravvivenza mediana libera da progressione che si avvicina ai 2 anni [16]. Anche nei casi di traslocazione ALK la maggior parte dei pazienti che avevano inizialmente risposto presenta una progressione di malattia, legata alla comparsa di resistenza al trattamento con crizotinib. In questi casi sono ora disponibili due nuovi farmaci a bersaglio molecolare (ceritinib e alectinib, già registrati negli Stati Uniti), che hanno una documentata eccellente efficacia anche nei pazienti con interessamento del sistema nervoso centrale.

Infine, negli ultimi anni sono comparse in letteratura diverse segnalazioni sull’impiego di inibitori di BRAF (vemurafenib e dabrafenib, già registrati per il melanoma avanzato) in pazienti con mutazione di BRAF (comunemente la mutazione V600E a carico dell’esone 15), che è presente in una percentuale tra l’1 e il 3% dei tumori polmonari non microcitomi. I tassi di risposta sono stati superiori al 50% con una durata della sopravvivenza globale superiore ai 2 anni [17].

Gli sviluppi della ricerca per i prossimi anni riguarderanno verosimilmente le alterazioni dei proto-oncogeni MET e RET, oltre che KRAS, per il quale finora non è stato possibile identificare trattamenti target.

Per quanto attiene alla proteomica, negli ultimi 10 anni sono stati indagati alcuni fattori predittivi di efficacia della chemioterapia: ERCC1, RMM1 e TS, rispettivamente coinvolti nella maggiore o minore sensibilità a platino, gemcitabina e pemetrexed. I risultati sono stati sin qui deludenti, in parte per la scarsa affidabilità dei test per la determinazione di ERCC1 [12, 18].

Nei prossimi mesi sono attesi i risultati di due importanti studi italiani (ITACA ed EPIC) che stanno valutando la possibilità di un approccio chemioterapico personalizzato sulla base dei marker citati, rispettivamente nel setting adiuvante e nella malattia avanzata dell’anziano.

Principali applicazioni cliniche e spunti di ricerca nel carcinoma mammario

Grazie a un grande investimento scientifico ed economico nell’approfondimento dell’architettura genomica, della trascrittomica e delle mutazioni somatiche delle neoplasie mammarie, la ricerca ha portato alla scoperta di una complessa eterogeneità della neoplasia non prima immaginata [19-21]. Nella pratica clinica odierna, la scelta terapeutica nel trattamento postoperatorio classicamente si basa su fattori clinici (età, performance status, comorbidità) e sulla definizione patologico-molecolare (istotipo, coinvolgimento linfonodale, definizione del profilo molecolare con valutazione dello stato recettoriale, del grading e dell’espressione immunoistochimica/assetto genico di HER2). Tuttavia, nella più appropriata scelta terapeutica per donne con neoplasia mammaria vi è certamente stata una notevole evoluzione grazie allo sviluppo delle tecniche di gene expression profile. Sebbene la raccomandazione all’utilizzo nella pratica clinica non sia a oggi comunemente accettata, vi sono due piattaforme di biologia molecolare approvate: Mammaprint (Agendia, Amsterdam, Paesi Bassi) e Oncotype DX (Genome Health, Redwood City, CA, US); la prima prevede uno studio di 70 geni con microarray, la seconda un profilo di espressione genica basato su real time-PCR. Entrambi i test genomici sono destinati a perfezionare la valutazione del rischio di recidiva dopo chirurgia radicale, a stimare con maggiore accuratezza il beneficio assoluto del trattamento chemioterapico postoperatorio [22] e a quantificare la possibile evoluzione in carcinoma invasivo di una neoplasia in situ [23]. Mentre l’implementazione del test genetico nella pratica clinica si è dimostrata fattibile e promettente [24], tra i più interessanti sviluppi della ricerca vi sono l’integrazione delle tecniche avanzate di radiologia con l’informazione molecolare per stimare in modo ancora più accurato il rischio di recidiva [25] e la combinazione di tecniche di proteomica e genomica per l’identificazione di mutazioni somatiche potenziali driver della neoplasia mammaria [26]. Inoltre, lo sviluppo di tecnologie high-throughput consente la dissezione della patologia a fenotipo triplo negativo (ER, PgR, HER2) in sottoclassi molecolari a differente rischio di recidiva [27] o con differente beneficio assoluto dal trattamento con i nuovi immunoterapici [28]. Sebbene vi sia un vivace interesse (preclinico) per la spettrometria di massa e per la spettroscopia con RMN nel campo delle neoplasie mammarie [29], la metabolomica rimane a oggi un campo di ricerca non direttamente applicabile alla pratica clinica [30]. Tra le mutazioni somatiche di maggiore interesse, considerando i potenziali risvolti terapeutici, segnaliamo: 1) lo studio di mutazioni di ERB2/HER2 (trastuzumab, pertuzumab, lapatinib, neratinib); 2) le mutazioni o le traslocazioni di ESR1, che predicono resistenza primaria o acquisita alla terapia antiormonale e che sono oggetto di sviluppo di nuovi farmaci a bersaglio specifico (palbociclib); 3) le mutazioni della via metabolica di PIK3CA, presenti in oltre il 30% dei tumori a fenotipo luminale B e in quasi il 50% di quelli a fenotipo luminale A, targettabili con farmaci specifici ma che al momento hanno dato risultati non omogenei; 4) le mutazioni di BRCA1 e 2 che, oltre a correlare con una predisposizione genetica alle malattie oncologiche, possono predire una maggiore sensibilità della cellula neoplastica ai sali di platino o ai PARP-inibitori [31].

Principali applicazioni cliniche e spunti di ricerca nei tumori cerebrali

Nella pratica clinica, un fondamentale discriminante che si affianca alla definizione istopatologia nella scelta terapeutica per le neoplasie cerebrali primitive è la caratterizzazione della metilazione del promotore di MGMT, gene situato nel locus 10q26 che codifica una proteina coinvolta nel sistema di riparazione del DNA [32]. Poiché un elevato livello di attività della proteina limita l’effetto terapeutico degli antiblastici alchilanti, la presenza del silenziamento epigenetico della stessa che avviene tramite metilazione del promotore genico ne potenzia l’azione. Vari studi clinici randomizzati hanno dimostrato il valore prognostico e predittivo della metilazione del promotore di MGMT soprattutto nella terapia con temozolomide [33-35], il cui utilizzo è entrato nella pratica clinica e consigliato nelle linee guida nazionali dell’Associazione Italiana di Oncologia Medica. Una recente esperienza dimostra come abbia maggiore valore la determinazione della metilazione di MGMT al momento della diagnosi e non alla recidiva, in quanto il pattern di metilazione potrebbe modificarsi dopo radio-chemioterapia [36]. Una seconda importante applicazione della genomica alle neoplasie cerebrali, consigliata ma non attualmente applicata a livello nazionale, consiste nella valutazione della co-delezione dei cromosomi 19/19q. Tale anomalia, che è più frequente nelle neoplasie oligodendrogliali e correla con la sede anatomica primitiva della malattia, ha una valenza predittiva e prognostica favorevole come dimostrato dalla differente sopravvivenza libera da progressione (PFS; 23 vs 13 mesi), sopravvivenza globale a 5 anni (OS; 70% vs 30%) e tasso di risposta al trattamento osservati in un recente studio clinico randomizzato [37]. La terza futuribile applicazione degli approfondimenti genomici in questa patologia è rappresentata dallo studio delle mutazioni somatiche nel codone 132 del gene che codifica per l’enzima isocitrato deidrogenasi di tipo 1 (IDH1), presente in circa il 15% dei glioblastomi. Tale mutazione, presente anche nei pazienti più giovani con diagnosi di astrocitoma anaplastico o glioblastoma, correla con una prognosi più favorevole ed è spesso associata al fenotipo metilatore. La presenza del fenotipo wild-type di IDH1 sembra associata a una ridotta sensibilità agli antiangiogenici, talvolta utilizzati in linea successiva in pazienti selezionati [38]. Un’interessante linea di ricerca in questa patologia consiste nel seguire l’evoluzione clonale delle cellule neoplastiche durante il corso del trattamento antiblastico specifico tramite tecniche di genomica e trascrittomica, potenzialmente accoppiabili al più moderno imaging funzionale [39].

Principali applicazioni cliniche e spunti di ricerca nei tumori del colon-retto

In circa il 20% dei carcinomi colorettali si riscontra la presenza di alterazioni geniche riconducibili a una trasmissione di tipo familiare [es. gene APC e cancro colorettale ereditario non poliposico (HNPCC)]; il restante 80% presenta alterazioni geniche che sono state oggetto di estensivo studio e che rivestono, a oggi, un ruolo fondamentale sia nel determinare la prognosi [40] che nel predire la risposta a trattamenti specifici quali l’utilizzo di agenti a target (es. inibitori dell’epidermal growth factor receptor). Nel setting adiuvante, dopo una resezione radicale della neoplasia primitiva, l’analisi dell’instabilità dei microsatelliti (MSI) riveste un ruolo importante nel determinare il rischio di ricaduta in pazienti operati radicalmente e, di conseguenza, nella decisione di proporre o meno un trattamento adiuvante [41,42]. L’indicazione all’analisi è suggerita dalle linee guida nazionali AIOM (il test dovrebbe essere eseguito in laboratori con documentata esperienza e volumi di attività specifica), in particolare per pazienti con un discutibile rapporto rischio/beneficio del trattamento. Il risultato dell’analisi MSI può far riconoscere una sottopopolazione di pazienti con malattia in stadio II e stabilità dei microsatelliti che presenta maggior rischio di ricaduta e alla quale può essere proposta una chemioterapia adiuvante basata su una doppietta contenente una fluoropirimidina e oxaliplatino. Un ulteriore sviluppo del test per MSI consiste nella possibilità di selezionare pazienti con potenziale maggiore beneficio all’immunoterapia (inibitori di PD-1 e PD-L1 come pembrolizumab, avelumab in combinazione a cobimetinib, atezolizumab). Certamente più articolato il panorama dell’analisi mutazionale dei geni KRAS, NRAS e BRAF, che dovrebbe essere routinariamente impiegata nella pratica clinica nella fase avanzata della malattia. In particolare, mutazioni KRAS (40%), NRAS (3-5%) e BRAF (5-20%) hanno un valore prognostico negativo e un deciso valore predittivo negativo per il trattamento con inibitori di EGFR (cetuximab e panitumumab), come dimostrato nelle analisi condotte su due importanti studi clinici internazionali randomizzati [43,44]. Tale ruolo predittivo negativo ha condotto le autorità regolatorie nazionali a restringere ai pazienti RAS wild-type la prescrivibilità dei suddetti inibitori di EGFR [45]. Altre alterazioni geniche non ancora entrate nella pratica clinica indicano l’importanza di ulteriori geni con significato prognostico: PIK3CA (10-30%), PTEN (20-50%) e AKT (38%) [46]. Attualmente sono oggetto di ricerca clinica e preclinica l’emergere di ulteriori mutazioni nei geni coinvolti nella via di trasduzione del segnale di EGFR e l’emergenza di meccanismi di resistenza legati ad altri geni che interagiscono con tale via, con qualche rilevante esperienza pratica riportata in letteratura [47,48].

Principali applicazioni cliniche e spunti di ricerca nel carcinoma gastrico

Dopo tre decenni di utilizzo esclusivo della sola chemioterapia, la ricerca di driver molecolari che potessero aprire la strada all’utilizzo di terapie con agenti a target ha condotto all’utilizzo nella pratica clinica di un HER2-inibitore in grado di migliorare la sopravvivenza globale (OS) fino a 13,8 mesi in una popolazione di pazienti selezionata per l’espressione di HER2. Tale dato ha condotto alla valutazione dell’espressione di HER2 tramite metodica immunoistochimica e analisi dell’assetto genico di HER2 mediante ibridazione in situ, su campioni istologici in pazienti con carcinoma gastrico metastatico [49]. Recentemente, due pubblicazioni [classificazione TCGA (The Cancer Genome Atlas) e classificazione ACRG (Asian Cancer Research Group)] hanno focalizzato l’attenzione sulla possibilità di identificare sottogruppi molecolari di carcinoma gastrico, caratterizzati da un pattern di espressione genica e proteomica differente, con opportunità di essere trattati con strategie terapeutiche basate su specifici driver molecolari [50,51]. La classificazione sviluppata in Europa (TCGA) prevede la suddivisione del carcinoma gastrico in quattro sottogruppi: CIN (Chromosomally Unstable Neoplasia, 50% della casistica), MSI (Microsatellite Instability, 22%), GS (Genomically Stable, 20%), EBV (Epstein-Barr Virus, 9%). Numerosi studi hanno inoltre indagato la possibilità di analizzare il genoma del carcinoma gastrico, individuare mutazioni o amplificazioni specifiche e trattare quest’ultime utilizzando strategie di precision therapy.

In particolare, nel gruppo dei carcinomi CIN, caratterizzati da elevata instabilità cromosomica, sarebbe possibile individuare amplificazioni, mutazioni e traslocazioni spesso mutuamente esclusive, che coinvolgono singoli geni “targettabili” con inibitori specifici. Esempi di queste alterazioni sono: HER2 (trattamento con trastuzumab, lapatinib, pertuzumab, TDM-1) [49,52-54], EGFR (cetuximab, panitumumab, nimotuzumab) [55-57], RAS e BRAF (MEK inibitori e inibitori di PIK3CA), FGFR2 (dovitinib) [58] e c-MET (rilotumab, onartuzumab) [59,60]. Un’ulteriore prospettiva sperimentale sarebbe quella di poter identificare pazienti caratterizzati da MSI, in analogia a quanto si prospetta per il carcinoma del colon, con maggiore sensibilità a immunomodulatori [61,62].

Principali applicazioni cliniche e spunti di ricerca nel melanoma

Il melanoma cutaneo rappresenta una patologia in cui alcune mutazioni driver rivestono il ruolo di fattore sia prognostico che predittivo. Infatti, accanto a fattori prognostici clinico-morfologici (sottotipo istologico, spessore di Breslow, indice mitotico, ulcerazione, infiltrazione linfocitaria), le mutazioni di BRAF sono presenti nel 50% dei melanomi (V600E nel 90% dei casi [63], ma anche mutazioni V600K, V600G/R) e si associano a prognosi negativa. Le mutazioni di NRAS sono invece presenti nel 30-40% dei casi, mutazioni di c-KIT nell’1-3% dei melanomi e in particolare in melanomi mucosali e acrali lentigginosi.

Nella pratica clinica la mutazione di BRAF V600E rappresenta il target di inibitori specifici quali vemurafenib [64,65] e dabrafenib [66], che si sono dimostrati (in pazienti molecolarmente selezionati) maggiormente efficaci in sopravvivenza se confrontati alla chemioterapia classica in studi randomizzati controllati. Attualmente i migliori risultati clinici in termini di sopravvivenza globale sono raggiungibili su pazienti con diagnosi di melanoma metastatico e mutazione di BRAF trattati con la combinazione di BRAF-inibitori e MEK-inibitori (es. dabrafenib in combinazione con trametinib) [66-68].

Un caso particolare è rappresentato dai melanomi mucosali e acrali lentigginosi, nei quali la mutazione di c-KIT non risulta infrequente (36-39% dei casi) [69] e dovrebbe essere ricercata per poter proporre, seppure non ancora in indicazione ufficiale, un trattamento con imatinib sulla base dell’alterazione genetica dimostrabile [70,71].

Infine, si pone in evidenza un tentativo del gruppo TCGA di classificare il melanoma cutaneo dal punto di vista molecolare (BRAF-mutati, NRAS-mutati, NF1-mutati, tripli negativi), sforzo che ha aperto la strada a ulteriori conoscenze nella comprensione dei meccanismi patogenetici della malattia e nel suo specifico trattamento [72].

Principali applicazioni cliniche e spunti di ricerca nella patologia oncologica del distretto capo-collo

Numerosi potrebbero essere altri esempi di utilizzo di tecniche di genomica e proteomica nei tumori del capo-collo. Tuttavia, allo stato attuale, tutti gli studi di genomica e proteomica sono da considerarsi ancora circoscritti solo all’ambito di ricerca.

Tutte le linee guida internazionali infatti non menzionano alcun biomarcatore molecolare con valore diagnostico, prognostico o predittivo, con l’eccezione di quanto riportato per l’analisi mutazionale dei tumori della tiroide per i casi con citologia indeterminata nelle linee guida del National Comprehensive Cancer Network (NCCN) e dell’American Thyroid Association (ATA) [73,74] e per la genotipizzazione del virus HPV nelle neoplasie squamose o a istologia indifferenziata a primitività sconosciuta, per la quale il valore predittivo ai fini della radioterapia rimane ancora controverso [75].

Patologia neoplastica delle cavità nasali, dei seni paranasali e del nasofaringe

I carcinomi delle cavità nasali e dei seni paranasali costituiscono il 3% di tutti i tumori del distretto capo-collo e lo 0,2-0,8% di tutti i tumori maligni.

Il tumore più comune del nasofaringe è il carcinoma nasofaringeo del tutto peculiare per la sua distribuzione etnico-geografica e per la sua associazione con il virus di Epstein-Barr (EBV).

L’insorgenza del carcinoma nasofaringeo si considera come il risultato di alterazioni genetiche somatiche variamente sommantesi fra di loro, con presenza pressoché ubiquitaria di infezione latente di EBV (EBNA1, LMP1, LPM2) in grado di alterare il pathway del segnale di trasduzione e contribuire alla trasformazione neoplastica dell’epitelio del nasofaringe (Figura 6).

 

Figura_6

Fig. 6. Evoluzione multistep del carcinoma nasofaringeo. (Mod. da [76]). LOH (loss of heterozygosity), perdita di eterozigosi

 

Tumori dell’ipofaringe e della laringe

Sull’etiologia tabacco-alcool correlata vi è accordo generale, mentre qualche controversia sussiste ancora oggi sulla reale capacità oncogenica dell’infezione da papilloma-virus (HPV), in particolar modo a motivo dei dati piuttosto contraddittori sulla reale implicazione carcinogenetica del genotipo 16 dell’HPV (dati variabili in letteratura dal 3% all’85%). Al momento non vi sono dati sufficienti o convincenti sulla suscettibilità genetica del carcinoma ipofaringo-laringeo, a eccezione dell’esistenza di alcuni polimorfismi su enzimi implicati nella detossificazione dell’alcool e del tabacco.

Per i cosiddetti tumori primitivi secondari, sincroni o metacroni, esistono studi con marcatori molecolari di clonalità e di profiling genico che evidenziano similarità e discordanze genetico-molecolari tra i due o più tumori primitivi secondari ovvero le loro eventuali metastasi.

Tumori del cavo orale e dell’orofaringe e precancerosi della mucosa del cavo orale (e della laringe): disordini potenzialmente maligni

Anche per il carcinoma del cavo orale e dell’orofaringe valgono gli stessi fattori etiologici menzionati a proposito dei tumori della laringe (fumo di tabacco, alcool, HPV…) e i concetti sulla field cancerization.

I disordini potenzialmente maligni sono lesioni della mucosa del cavo orale (e della laringe) caratterizzati da un rischio più elevato di sviluppare un carcinoma rispetto alla mucosa normale [77, 78] (Tabella 5).

 

Tabella 5. Classificazione istologica che categorizza lesioni precursori e lesioni correlate. (Mod. da [76])

Classificazione WHO 2005 Neoplasia squamosa
intraepiteliale (SIN)
Classificazione di Ljubljana delle Lesioni squamose intraepiteliali (SIL)
Iperplasia a cellule squamose Iperplasia (semplice) a cellule squamose
Displasia debole SIN 1 Iperplasia delle cellule basali/parabasali
Displasia moderata SIN 2 Iperplasia atipica
Displasia severa SIN 3 Iperplasia atipica
Carcinoma in-situ SIN 3 Carcinoma in-situ

 

A livello di linee guida NCCN (versione 1.2015), gli unici biomarcatori raccomandati a significato prognostico sono l’analisi dell’infezione da HPV con ibridazione in situ, ovvero analisi immunoistochimica di p16 come marker surrogato di infezione da HPV [75]. Alcuni trial clinici [79,80] hanno evidenziato che i pazienti con carcinoma HPV-positivo rispondono meglio al trattamento radiante con vantaggi nella sopravvivenza e progressione libera da malattia quando comparati con i tumori HPV-negativi. Pertanto lo stato di HPV può essere utilizzato come biomarcatore per stratificare i pazienti. Alcuni autori suggeriscono la possibilità di un trattamento radiante deintensificato per i pazienti HPV-positivi [81, 82]. Tuttavia il panel NCCN non raccomanda questo approccio, in quanto i dati sono ancora insufficienti e non giustificano l’estensiva analisi dello stato di infezione da HPV, limitando l’indicazione al test solo per i pazienti con tumore a sede primitiva sconosciuta. Nelle neoplasie squamose o a istologia indifferenziata a primitività sconosciuta è suggerita la ricerca di EBV e HPV come ausilio per l’individuazione del campo di irradiazione, tenendo conto che un test HPV-positivo suggerisce fortemente una localizzazione primaria nella tonsilla o nella base della lingua [75].

Un aspetto innovativo di utilizzo di metodiche molecolari avanzate è quello della biopsia liquida per la ricerca nel plasma e nella saliva dei soggetti con carcinoma del cavo orale e/o delle regioni ipofaringo-laringee di frammenti di DNA circolante del genoma virale dell’HPV come biomarcatore per rilevare la presenza di un carcinoma HPV-correlato. Wang et al. sono riusciti a evidenziare DNA tumorale nella saliva nel 76% e nel sangue nell’84% dei pazienti da loro studiati e ciò avrebbe permesso di rilevare precocemente 16 casi di carcinoma orofaringeo, sette di carcinoma laringeo e due di carcinoma ipofaringeo. I test sulla saliva si sono rivelati maggiormente efficaci per l’identificazione del carcinoma del cavo orale anche nelle prime fasi del suo sviluppo, mentre i test sul sangue sono stati in grado di individuare il carcinoma in una fase più avanzata. Tuttavia, non vi sono ancora dati certi e definitivi sul tasso di falsi positivi [83]. Anche tecniche di proteomica sono state utilizzate sulla saliva ipotizzando un potenziale utilizzo della saliva come campione diagnostico [84].

Neoplasie maligne della tiroide

Nel gruppo di persone fra i 20 e i 34 anni il carcinoma della tiroide rappresenta il 15% di tutte le neoplasie maligne. Risulta 2-3 volte più frequente nelle donne. Può insorgere a qualsiasi età con picco di insorgenza sui 50 anni. Gli istotipi più frequenti sono:

  • il carcinoma differenziato (papillare, follicolare e a cellule di Hurthle)
  • il carcinoma midollare
  • il carcinoma poco differenziato insulare
  • il carcinoma anaplastico.

Le percentuali di frequenza per istotipo sono 89% per il carcinoma papillare, 5,1% per il carcinoma follicolare, 2,2% per il carcinoma a cellule di Hurthle, 1,7% per il carcinoma midollare e 0,8% per il carcinoma anaplastico.

Il 95% dei noduli riscontrati a livello tiroideo risultano essere biologicamente benigni [73]. Tuttavia la loro distinzione non risulta sempre agevole dal punto di vista morfologico, specialmente quando il primo step diagnostico è l’esame citologico per ago-aspirazione (fine needle aspiration, FNA) e in modo particolare quando la diagnosi rientra nelle categorie TIR3a e TIR3b [85]. Come noto, le azioni cliniche che sottendono a queste due categorie sono la ripetizione della FNA con follow-up clinico per il TIR3a e il ricorso da subito alla chirurgia per il TIR3b, considerando che il rischio atteso di ritrovare una neoplasia maligna è del 5-15% per il TIR3a, ma del 10-30% per il TIR3b. I criteri citomorfologici e di adeguatezza diagnostica dei preparati citologici, ancorché da tempo validati, non sempre sono in grado, anche attraverso vari pannelli immunocitochimici, di discriminare con sicurezza e affidabilità di valore predittivo positivo e valore predittivo negativo queste due categorie diagnostiche. Seppure non indicato nel documento di consenso italiano, da qualche tempo si è tentato di ovviare a queste difficoltà ricorrendo all’analisi molecolare, utilizzando il materiale citologico per ago-aspirazione con vari approcci metodologici per singola mutazione o per multiple mutazioni contemporaneamente, allo scopo di offrire un ulteriore ausilio decisorio nel corretto management clinico di questi pazienti a citologia “indeterminata” [85].

Nelle linee guida americane NCCN (versione 2.2015) [73], per i casi con citologia indeterminata, rappresentati dalle categorie Follicular or Hurthle cell neoplasme AUS/FLUS (Atypia of undetermined significance e Follicular lesions of undetermined significance), viene raccomandata la ricerca delle mutazioni a carico dei seguenti geni: BRAF, RET/PTC, RAS, PAX/PPAR gamma. La mutazione BRAF V600E si riscontra nel 45% dei carcinomi papillari ed è la più frequente mutazione, anche se esistono controversie circa un suo effettivo ruolo prognostico. Tuttavia le linee guida sottolineano che l’implementazione dei test molecolari nella pratica clinica richiede comunque una conoscenza adeguata del significato biologico delle mutazioni e del valore predittivo delle stesse e che il dato genetico sia inquadrato opportunamente nel quadro clinico/citologico. Dello stesso parere sono le linee guida dell’ATA, sempre del 2015 [74].

A oggi i tre approcci molecolari disponibili sono:

  • 7-genes panel di mutazioni genetiche: BRAF, RET/PTC, RAS, PAX/PPAR gamma (considerato un test “rule-in” tenuto conto del suo elevato valore predittivo positivo, con una sensibilità variabile dal 44 al 100%);
  • gene expression classifier di 167 microRNA, considerato un test “rule-out” tenuto conto del suo elevato valore predittivo negativo;
  • pannello di immunoistochimica (es. Galectina-3, HBME-1…) da eseguirsi su campione citologico allestito come citoincluso.

 

Considerazioni conclusive

Le tecnologie “Omics” nei loro vari livelli riferiti alla genomica, all’epigenomica, alla trascriptomica, alla proteomica e alla metabolomica… stanno fornendo un’impressionante mole di dati che, tenuto conto della loro complessità gestionale e interpretativa, devono necessariamente integrarsi con la bioinformatica con indubbie difficoltà. Un gran numero di biomarcatori sono stati individuati con le più svariate piattaforme tecnologiche, ciascuno con caratteristiche fisiopatologiche assai diverse.

Tuttavia, allo stato attuale delle conoscenze, si rendono ancora necessarie estensive validazioni di questi approcci per verificare il loro effettivo utilizzo come biomarcatori a ricaduta clinica. L’auspicio futuro è quello di essere in grado di integrare i poderosi dati “multiomici” fra loro per trasferirli nella pratica clinica.


 

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